一、摘要

利用Liberty Blue™自動化微波多肽合成儀，通過微波增強(qiáng)的固相多肽合成（SPPS）技術(shù)，可以快速合成高純度的烴鍵合多肽。在不到4小時內(nèi)，我們成功合成了一種促凋亡BID鍵合多肽衍生物，即BID SAHB（BCL-2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定α螺旋）1，其純度達(dá)到了80%。同樣，一種促凋亡的BIM鍵合多肽，BIM SAHB2，也在不到4小時的時間內(nèi)制備完成，純度同樣為80%。

二、介紹

肽鍵合是穩(wěn)定α-螺旋的一種有效策略，而α-螺旋是決定各種肽和蛋白質(zhì)生物活性的重要結(jié)構(gòu)單元。³特別是碳?xì)滏I合技術(shù)已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的方法來穩(wěn)定α-螺旋，已經(jīng)產(chǎn)生了多個具有更高靶標(biāo)親和力和顯著增強(qiáng)抗蛋白酶能力的肽例子。⁴此外，一些碳?xì)滏I合的肽被證明比其未鍵合的類似物具有更大的細(xì)胞通透性和體內(nèi)活性^2,5，這進(jìn)一步激發(fā)了將α-螺旋肽用于治療應(yīng)用的努力。⁶

碳?xì)滏I合的肽可以通過使用側(cè)鏈末端帶有烯烴的氨基酸進(jìn)行SPPS（固相多肽合成）制備，例如Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH（圖1左）⁷。在合成前綴鍵合的肽后，可以通過環(huán)閉合復(fù)分解反應(yīng)（RCM）使用Grubbs催化劑™第一代（圖1右）⁷制備鍵合變體。傳統(tǒng)的室溫合成鍵合肽通常是一個耗時的過程，20個氨基酸長度的肽需要超過30小時的合成時間。將微波能量應(yīng)用于碳?xì)滏I合肽的合成可以更有效地耦合，從而提高合成時間和高純度（CarboMAX）。⁸

圖1：（左）Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH；（右）Grubbs催化劑第一代

三、材料與方法

試劑

以下Fmoc氨基酸購自CEM公司（馬修斯，北卡羅來納州），并含有指示的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Boc), Ser(tBu), Trp(Boc)和Tyr(tBu)。Rink Amide ProTide™LL樹脂也購自CEM公司。Grubbs催化劑^TM第一代、Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH、N,N’-二異丙基碳二亞胺（DIC）、哌啶、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT）、三異丙基硅烷（TIS）和醋酸酐（Ac₂O）購自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密蘇里州）。1,2-二氯乙烷（DCE）購自Alfa Aesar（哈弗希爾，馬薩諸塞州）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、無水乙酉迷（Et₂O）、醋酸、高效液相色譜級水和乙腈購自VWR（西切斯特，賓夕法尼亞州）。LC-MS級水（H₂O）和LC-MS級乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（沃爾瑟姆，馬薩諸塞州）。

肽合成：BID SAHB, Ac-EDIIRNIARHLA(S5)VGD(S5)LDRSIW-NH₂

該肽（圖2）是在0.05mmol規(guī)模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脫保護(hù)使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。耦合反應(yīng)使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在E的Fmoc脫保護(hù)后使用10% Ac₂O在DMF中進(jìn)行。環(huán)閉合復(fù)分解鍵合反應(yīng)使用10mM Grubbs催化劑第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統(tǒng)進(jìn)行，切割液為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并過夜凍干。

圖2：碳?xì)滏I合的BID SAHB

肽合成：BIM SAHB, Ac-IWIAQELR(S5)IGD(S5)FNAYYARR-NH₂

該肽（圖3）是在0.05mmol規(guī)模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脫保護(hù)使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。耦合反應(yīng)使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在I的Fmoc脫保護(hù)后使用10% Ac₂O在DMF中進(jìn)行。環(huán)閉合復(fù)分解鍵合反應(yīng)使用10mM Grubbs催化劑第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統(tǒng)進(jìn)行，切割液為TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并過夜凍干。

圖3：碳?xì)滏I合的BIM SAHB

肽分析

肽在配備PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析，該系統(tǒng)裝有Acquity UPLC BEH C8柱（1.7微米和2.1 x 100毫米）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100單四極桿質(zhì)譜儀用于結(jié)構(gòu)測定。峰分析通過Waters MassLynx軟件完成。分離采用梯度洗脫，流動相為0.05% TFA在（i）H₂O和（ii）MeCN中的混合物。

四、結(jié)果

使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進(jìn)行微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS），成功制備了BID SAHB目標(biāo)肽，純度達(dá)到80%（圖4）。

圖4：BID SAHB的UPLC色譜圖

使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進(jìn)行微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS），成功制備了BIM SAHB目標(biāo)肽，純度達(dá)到80%（圖5）。

圖5：BIM SAHB的UPLC色譜圖

五、結(jié)論

使用微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）可以快速高效地合成碳?xì)滏I合肽。傳統(tǒng)的室溫下BID SAHB肽的合成需要超過35小時的合成時間來生成未鍵合的肽，并且還需要額外的3-6小時進(jìn)行鍵合。⁷通過微波增強(qiáng)的SPPS，在不到4小時內(nèi)即可合成純度為80%的鍵合肽。傳統(tǒng)的BIM SAHB肽的室溫合成需要33小時的人工操作時間，并且還需要額外的3-6小時進(jìn)行鍵合。⁷另一方面，微波增強(qiáng)的SPPS在不到4小時內(nèi)即可提供純度為80%的鍵合肽。