01 摘要
碳水化合物化合物可利用 RediSep Gold Amine 色譜柱結合蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）進行簡便的純化。該色譜柱采用親水相互作用液相色譜（HILIC）梯度洗脫法，以乙腈或丙酮與水的梯度進行操作。將待純化的樣品溶解于 DMSO 中，不僅允許大量樣品加載，同時還能保持良好的分辨率。
02 背景
碳水化合物通常采用氨基柱進行分析，該方法具有良好的分辨率。這種分析方法一般使用乙腈和水作為流動相，樣品通常溶解在水中。由于樣品注射量較小，樣品有機會吸附在固定相上。在制備色譜中，相對于色譜柱尺寸而言，樣品負載和注射體積要大得多，因此將樣品溶于水中注射會讓樣品引無法吸附在柱子上，然后在空隙處洗脫。干法加載樣品到固體裝載小柱上（由固體裝載小柱實施干法加載）常用于快速色譜，但用戶需要自己用氨基介質填充他們的小柱。樣品仍然溶解在水中進行加載，這需要很長時間才能在運行樣品前蒸發(fā)。
二甲基亞砜（DMSO）常用于反相色譜的樣品溶解，因為它能溶解大多數(shù)化合物。DMSO 能夠溶解碳水化合物，但在 HILIC 中是一種弱溶劑，因此它允許樣品吸附在柱子上。在使用氨基柱時，DMSO 在 洗脫早期被洗脫；然而，在采用非氨基介質的其他 HILIC 運行中，它可能在梯度洗脫的后期才被洗脫。
03 結果與討論
雖然親水相互作用液相色譜（HILIC）屬于正相色譜，但它使用的溶劑通常適用于反相色譜，因此需要根據(jù)表 1 中的設置調整蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的參數(shù)，以保持基線穩(wěn)定的同時維持靈敏度。
表1. 純化碳水化合物的蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）設置。
ELSD控制 | 設置值 |
Spray Chamber | 20℃ |
Drift Tube | 60℃ |
Gain | 1 |
Sensitivity | High |
樣品均溶解于 DMSO 中。如有必要，將樣品在熱水浴中加熱以促進溶解。使用 PeakTrak Flash Focus 梯度生成器在系統(tǒng)上開發(fā)方法。運行了一個亻貞查梯度以驗證樣品能夠被洗脫，并證明化合物之間有足夠的分辨率以實現(xiàn)成功的純化。化合物的滯留時間用于計算聚焦梯度的溶劑比例。 本文中所有運行 均使用 RediSep Gold® 氨基柱。運行完成后，用2-丙醇洗滌并儲存柱子，2-丙醇與有機溶劑混溶，可實現(xiàn) 快速純化低極性化合物。
第一個實例使用了核糖和葡萄糖。亻貞查梯度和聚焦梯度都使用乙腈作為弱溶劑。亻貞查運行只用了少量幾毫克，并且為了提高這個小樣品負載的靈敏度，ELSD 增益被調高到 3。第二個洗脫峰用于聚焦梯度；計算梯度后，ELSD 增益被重置為 1 以保持 ELSD 響應在量程內。本案例使用50克的RediSep Gold氨基管柱分離100毫克混和物。
果糖和蔗糖通常一起出現(xiàn)在樣品中。圖 2 展示了從雜質中純化果糖的過程。該混合物以與核糖-葡萄糖樣品類似的方式運行，但改採行梯度聚焦于葡萄糖。在約 1.8 柱體積（CV）出現(xiàn)的峰是用于溶解樣品的 DMSO。
圖1. 核糖和葡萄糖在 5.5 克 RediSep Gold Amine 柱上運行亻貞查方法（上圖），并聚焦到 50 克 RediSep Gold 胺柱上。樣品總負載量為核糖和葡萄糖各 50 毫克。聚焦梯度中約 1.8 柱體積處的小峰是 DMSO。
圖2. 使用 RediSep Gold Amine 柱和乙腈/水梯度從蔗糖中純化不純的果糖。
04 丙酮作為弱溶劑
丙酮也是 HILIC 的弱溶劑，可以替代乙腈使用。盡管醇類可以用于 HILIC，但這些溶劑對于在胺柱上純化碳水化合物來說太強了。使用丙酮純化了一個果糖和葡萄糖的樣品。
該混合物的純化方式與之前的例子相似，除了運行亻貞查梯度時使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold Amine 柱，因為 PeakTrak 允許使用任何尺寸的 Teledyne ISCO 柱進行亻貞查運行。聚焦梯度使用了一根 50 克的 RediSep Gold Amine 柱，但計算出的梯度需要較低的水濃度來純化葡萄糖，這表明對于這些化合物，丙酮是比乙腈更強的溶劑。
圖3. 使用丙酮/水梯度純化的果糖和蔗糖。亻貞查運行使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold 胺柱。
05 結論
使用PeakTrak Flash Focus Gradient Generator（梯度生成器）搭派上Teledyne ISCO的所有色譜管住，這可以幫助您迅速找出蕞適合洗脫條件，并提升純化量能。
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